IP（免疫沉淀）与Co-IP（共免疫沉淀）是解析蛋白表达及蛋白互作网络的重要技术，在蛋白组学与质谱分析中被广泛应用。然而，在实际实验中，研究人员常遇到目标蛋白信号极低甚至无法检测的情况，这不仅影响结果可靠性，也增加了实验重复成本。IP实验主要反映单蛋白的富集效率，而Co-IP则依赖蛋白复合物的稳定性及弱相互作用的保持，因此二者在失败机制上存在显著差异。同时，质谱分析环节的肽段覆盖率、检测灵敏度及动态范围也直接影响最终信号的获取。总体来看，IP/Co-IP低信号问题是样本制备、免疫捕获和质谱检测三层因素共同作用的结果，需要系统性优化策略加以解决。

一、IP/Co-IP低信号或失败的关键机制解析

1、样本裂解与复合物稳定性破坏

(1) 裂解条件破坏蛋白复合物结构

IP/Co-IP中常用RIPA或高盐裂解体系（≥300 mM NaCl）可能破坏弱相互作用蛋白复合物，导致Co-IP信号消失。

(2) 去污剂影响抗原构象

SDS、NP-40或Triton X-100浓度过高（>1%）可能导致抗原表位结构改变，降低抗体识别效率。

(3) 蛋白降解与修饰丢失

未加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂时，短时间内即可出现互作蛋白降解或修饰状态丢失。

2、抗体结合效率与沉淀体系限制

(1) 抗体Kd与捕获效率不匹配

低亲和力抗体（Kd >10⁻⁸ M）在低丰度蛋白体系中极易导致捕获失败。

(2) 抗体-磁珠体系不匹配

Protein A/G对IgG亚型结合存在差异，不匹配会降低抗体捕获效率。

(3) 非特异竞争与背景干扰

IgG链与高丰度蛋白（如HSP90、Actin）竞争结合位点，降低目标蛋白富集比例。

3、质谱检测灵敏度与数据采集限制

(1) 动态范围限制导致低丰度蛋白丢失

Orbitrap类质谱具有较宽的动态检测能力，但在复杂样本中，低丰度互作蛋白可能被高丰度肽段掩盖。

(2) DDA采集模式随机性缺失信号

DDA存在“missing value”问题，低丰度肽段无法稳定触发MS/MS扫描。

(3) 肽段离子化抑制效应（Ion Suppression）

复杂样本中盐离子或高丰度肽段会显著抑制目标肽段电离效率。

图1

二、IP/Co-IP信号提升与质谱优化策略

1、样本制备与复合物保护优化

(1) 优化裂解体系强度平衡

推荐使用150–250 mM NaCl + 0.1–0.5% NP-40条件，在保持复合物稳定与裂解效率之间平衡。（具体浓度和比例应根据样本类型、目标蛋白特性以及抗体/复合物稳定性进行调整）

(2) 全程低温+快速处理策略

4°C操作环境下缩短裂解至免疫沉淀时间（<30 min），降低复合物解离概率。（实际处理时间需根据样本量和复合物稳定性灵活确定）

(3) 增加蛋白稳定保护体系

使用EDTA-free蛋白酶抑制剂组合，防止蛋白降解及修饰丢失。

2、抗体与免疫沉淀体系优化

(1) 优先选择验证型IP-grade抗体

避免使用仅用于WB的抗体，应选择经Co-IP验证抗体。

(2) 优化抗体与磁珠比例

通过梯度实验确定最佳捕获比例，避免抗体浪费或捕获不足。

(3) 降低非特异结合背景

使用预清除（pre-clearing）步骤降低非特异蛋白结合率。

3、质谱检测与数据采集优化

(1) 优先采用DIA提升低丰度检测能力

DIA相比DDA在复杂样本中具有更稳定的低丰度蛋白检测表现。

(2) 优化LC梯度延长分离时间

提高肽段分离度，降低共洗脱干扰。

(3) 优化离子注入与AGC参数

提高AGC target与maximum injection time以增强低信号采集能力。

图2

三、IP/Co-IP失败样本的系统解决路径

在复杂实验失败场景中，单一优化往往不足，应采用系统性重构策略：

· 样本层：复合物保护 + 浓缩策略优化

· 抗体层：亲和力筛选 + 体系匹配验证

· 质谱层：DIA重分析 + 深度覆盖策略

该多层优化模型可显著提升低丰度蛋白互作网络解析能力，尤其适用于信号弱、背景高或重复性差样本。

IP/Co-IP样本蛋白低信号或检测失败通常不是单一因素造成，而是样本裂解条件、抗体捕获效率以及质谱检测灵敏度等多环节共同作用的结果。针对复杂或低信号样本，通过体系级优化可以显著改善检测效果，包括重建实验体系、开展蛋白互作网络的质谱深度分析以及针对低丰度蛋白的DIA重分析策略。百泰派克生物科技提供全流程IP/Co-IP蛋白互作检测与质谱分析服务，从实验设计、样本优化到数据解析，均可提供定制化解决方案。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

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